共聚焦激光掃描顯微鏡的應(yīng)用及熒光探針
一、LSCM常用的檢測(cè)內(nèi)容及其熒光探針
LSCM檢測(cè)內(nèi)容和應(yīng)用范圍非常廣泛，以下僅簡(jiǎn)單介紹LSCM常用的檢測(cè)內(nèi)容及其熒光探針。
1．細(xì)胞內(nèi)游離鈣 共聚焦激光掃描顯微鏡常用的有Fluo-3、Rhod-1、Indo-1、Fura-2等，前兩者為單波長(zhǎng)激光探針，利用其單波長(zhǎng)激發(fā)特點(diǎn)可直接測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)變化，為鈣定性探針；后兩者為雙波長(zhǎng)激發(fā)探針，利用其雙波長(zhǎng)激發(fā)特點(diǎn)和比率技術(shù)，能定量細(xì)胞內(nèi)i，為鈣定量探針。
定量細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i也可用雙波長(zhǎng)激發(fā)探針I(yè)ndo-1和Fura-2。由于這些探針須用比率技術(shù)，因此又稱為鈣比率探針。
鈣比率探針在溶液中均有熒光，測(cè)量時(shí)須洗去細(xì)胞外液探針，而進(jìn)入細(xì)胞后的探針其AM被分解后不能透出質(zhì)膜。由于這些探針要用紫外激發(fā)光作激發(fā)光源，會(huì)造成細(xì)胞的損傷，還會(huì)增加潛在的自發(fā)熒光，而且熒光發(fā)射峰波長(zhǎng)也較短，須提高發(fā)光強(qiáng)度，因而其使用受到一定的限制。
2． DNA和RNA?搖核酸的熒光探針 用于共聚焦激光掃描顯微鏡的主要有Acridine Orange(吖啶橙，AO)、Propidium Iodide(碘化丙啶，PI)。兩種染料既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA，如為獲得單獨(dú)的DNA或RNA分布，染色前可用RNA酶或DNA酶處理細(xì)胞。PI不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜，故不能標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA。
3． 膜電位 以往測(cè)定膜電位多用微電極直接插入法測(cè)量，不僅操作麻煩，而且對(duì)細(xì)胞也是一種損傷。共聚焦激光掃描顯微鏡則可利用熒光探針在細(xì)胞膜內(nèi)外分布的差異測(cè)出膜電位，不但可以觀察細(xì)胞膜電位的變化結(jié)果，更重要的是可以用于連續(xù)監(jiān)測(cè)膜電位的迅速變化。
膜電位熒光探針根據(jù)其對(duì)膜電位變化反應(yīng)速度的快慢分為快、慢兩類探針，各類均有10多種。DiBAC4(3)為最常用的膜電位熒光探針，DiBAC4(3)為帶負(fù)電荷的陰離子慢反應(yīng)染料。該探針本身無(wú)熒光，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光，測(cè)量時(shí)要求細(xì)胞浸在熒光染料中。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加即膜電位增加示細(xì)胞去極化；反之，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度降低即膜電位降低示細(xì)胞超極化。Rhodamine 123主要用于線粒體膜電位測(cè)量。Rhodamine123是一種親脂性陽(yáng)離子熒光探針，當(dāng)線粒體膜內(nèi)側(cè)負(fù)電荷增多時(shí)，熒光強(qiáng)度增加，與DiBAC4(3)的表示形式相反。
4． pH值 正常細(xì)胞胞漿內(nèi)的pH一般在6.8～7.4的范圍，而某些細(xì)胞器如溶酶體的pH則在4.5～6.0之間。根據(jù)檢測(cè)對(duì)象pH的不同將熒光探針?lè)譃橛糜谄行院退嵝詢深?。常用于偏中性pH即細(xì)胞胞漿pH檢測(cè)的熒光探針有SNARF類(SNARF-1、SNARF-calcein)、SNAFL類(SNAFL-1、SNAFL-calcein)、BCECF等，這些探針均為疏水性探針，須使用其AM形式。
FITC-dextran則適用于pH范圍4～6之間，如溶酶體pH的檢測(cè)，該探針也不能透過(guò)質(zhì)膜，但可通過(guò)細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入溶酶體，因此應(yīng)選擇分子量稍小的Dextran(葡聚糖)。
5． 細(xì)胞內(nèi)活性氧基 活性氧(active oxygen species)可影響細(xì)胞代謝，與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等發(fā)生反應(yīng)，有些反應(yīng)是有害的，因此測(cè)量活性氧在毒理學(xué)研究中有一定的意義。根據(jù)檢測(cè)活性氧的不同可選擇不同的熒光探針。
常用熒光探針有Dichlorodihydrofluorescein diacetate(2，7-二氯二氫熒光素乙酰乙酸、H2DCFDA)，其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被存在的過(guò)氧化物、過(guò)氧化氫等氧化分解為二氯熒光黃（dichlorofluorescein，DCF)而產(chǎn)生熒光，其反應(yīng)靈敏到10～12 mole水平，熒光強(qiáng)度與活性氧的濃度呈線性關(guān)系。
6． 細(xì)胞間通訊 共聚焦激光掃描顯微鏡可采用熒光光漂白恢復(fù)(fluorescence recovery after photobleading，F(xiàn)RAP)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞縫隙連接通訊，該方法的原理是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅，失去發(fā)光能力。
而臨近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過(guò)縫隙連接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中，熒光可以逐漸恢復(fù)。由于光漂白過(guò)程是不可逆的，因此可通過(guò)觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過(guò)程的變化量來(lái)判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能。
采用FRAP技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞間通訊常用熒光探針是6-carboxyfluorescein diacetate(6-羧基熒光黃乙酰乙酸鹽、CFDA)，需用其酯化形式CFDA-AM。該技術(shù)可用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過(guò)程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用。
由于某些毒性物質(zhì)尤其是促癌物可影響縫隙連接介導(dǎo)的物質(zhì)運(yùn)輸，因此該方法也可用于鑒別對(duì)縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。
7． 細(xì)胞膜流動(dòng)性 采用熒光光漂白恢復(fù)(FRAP)技術(shù)還可對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行研究。利用NBD-C6-HPC熒光探針標(biāo)記細(xì)胞膜磷脂，然后用高強(qiáng)度的激光束照射活細(xì)胞膜表面的某一區(qū)域(1～2μm)，使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白，再用較弱的激光束照射該區(qū)域?？蓹z測(cè)到細(xì)胞膜上其他地方未被漂白的熒光探針流動(dòng)到漂白區(qū)域時(shí)的熒光重新分布情況。熒光恢復(fù)的速率和程度可提供有關(guān)的信息。
8． 細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)(細(xì)胞器探針)?搖 一般的光學(xué)顯微鏡由于分辨率有限，在觀察細(xì)胞器結(jié)構(gòu)時(shí)受到一定的限制，而共聚焦激光掃描顯微鏡可獲得較一般普通光學(xué)顯微鏡分辨率高的細(xì)胞內(nèi)線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等細(xì)胞器圖像，同時(shí)還可動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞狀態(tài)下細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化情況，此外還可通過(guò)光學(xué)切片即斷層掃描技術(shù)進(jìn)行三維重建，顯示細(xì)胞器的空間關(guān)系及其變化。
適用于線粒體的熒光探針較多，如Mitotracker、DA SPMI、DA SPEI、JC-1、羅丹明 123等。高爾基復(fù)合體常用的熒光探針有NBD 酰基鞘氨醇（ceramide）、BODIPY ?；拾贝?。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用Dil、DiOC6(3)。溶酶體的熒光探針有DAMP、neutral red。
9． 標(biāo)記抗體、配體等常用的熒光探針 共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可用免疫熒光分析固定的細(xì)胞或組織切片，還可用于分析活細(xì)胞，得到特異性抗體或其他熒光免疫探針識(shí)別靶分子的表達(dá)、定位、分布變化等信息。
標(biāo)記抗體、配體或蛋白質(zhì)等較通用的有異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)，在堿性條件下FITC的異硫氰酸基與免疫球蛋白的自由基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳胺基鍵，成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個(gè)IgG分子上最多能標(biāo)記15～20個(gè)FITC分子。
但FITC易產(chǎn)生光漂白現(xiàn)象，發(fā)射帶較寬，故在用于雙標(biāo)記時(shí)會(huì)和其他染料的發(fā)射帶重疊，且?guī)ж?fù)電荷，對(duì)pH值的變化較敏感，因而限制了其在活細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。
10． 檢測(cè)酶活性的熒光探針 共聚焦激光掃描顯微鏡除了具備熒光顯微鏡檢測(cè)熒光酶細(xì)胞化學(xué)的作用以外，在檢測(cè)活細(xì)胞酶活性動(dòng)態(tài)變化方面有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)細(xì)胞施予不同的處理因素可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶被激活或滅活的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。有的酶熒光探針是自身就可發(fā)出熒光、有的是與酶結(jié)合后發(fā)出熒光、有的則是被酶分解后發(fā)出熒光。
以往記錄熒光信號(hào)的儀器主要有熒光顯微鏡、熒光分光光度儀、流式細(xì)胞儀等。與這些儀器相比，共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可廣泛用于熒光定性、定量測(cè)量，同時(shí)具備細(xì)胞斷層掃描、三維圖像重建、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測(cè)、熒光光漂白恢復(fù)、激光顯微外科等方面的功能。
此外，共聚焦激光掃描顯微鏡還可用于多重?zé)晒馊旧臋z測(cè)，如同時(shí)觀察細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，也可同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣和pH或膜電位等的動(dòng)態(tài)變化?？偠灾?，共聚焦激光掃描顯微鏡可進(jìn)行多參數(shù)、多功能的研究，且快速準(zhǔn)確、自動(dòng)化程度高，是檢測(cè)組織細(xì)胞熒光信號(hào)的最為新穎和先進(jìn)的技術(shù)手段。
二、共聚焦熒光探針的選擇
共聚焦激光掃描顯微鏡是20世紀(jì)80年代來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型高精度顯微鏡系統(tǒng)，輔以各類熒光探針或熒光染料與被測(cè)物質(zhì)特異性結(jié)合，不僅可觀察固定的細(xì)胞、組織切片，還可對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察和檢測(cè)。
熒光探針的發(fā)展非常迅速，目前僅美國(guó)Molecular Probes公司就可提供1800多種熒光探針，每年該公司還不斷推出新的熒光探針。通常每項(xiàng)檢測(cè)內(nèi)容或被測(cè)物質(zhì)都有幾種或幾十種有關(guān)的或特異的熒光探針。
1． 選擇熒光探針的一般考慮 選擇合適的熒光探針是有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并獲取理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障。熒光探針的選擇主要從以下幾個(gè)方面考慮。
（1）儀器所采用激光器的類型：應(yīng)根據(jù)儀器采用激光器的類型進(jìn)行探針選擇。如共聚焦激光掃描顯微鏡(Bio-Rad 1024，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品)采用氪/氬離子激光器，激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，568nm，647nm，可激發(fā)多種熒光探針。
（2）熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性：在進(jìn)行熒光定量和動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測(cè)時(shí)，要求熒光探針有較高的光穩(wěn)定性，也可通過(guò)減少激光掃描次數(shù)或降低激光強(qiáng)度的方法，來(lái)減輕光漂白的程度。但在進(jìn)行膜流動(dòng)性或細(xì)胞間通訊檢測(cè)時(shí)則需要熒光探針既有一定的光穩(wěn)定性又要有一定的光漂白性。
（3）熒光的定性或定量：僅做熒光定性或僅是觀察熒光動(dòng)態(tài)變化時(shí)，選擇單波長(zhǎng)激發(fā)探針，無(wú)須制作工作曲線。做定量測(cè)量時(shí)最好選用雙波長(zhǎng)激發(fā)比率探針，利于制定工作曲線。
（4）熒光探針的特異性和毒性：盡量選用毒性小、特異性高的探針。
（5）熒光探針適用的pH：大多數(shù)情況下細(xì)胞的pH在生理?xiàng)l件下，但當(dāng)pH不在此范圍時(shí)，考慮適用該環(huán)境pH的熒光探針是有必要的。同時(shí)應(yīng)注意染液自身的pH值會(huì)影響帶電荷的熒光探針與胞內(nèi)組分之間的結(jié)合，因此在染液的配備時(shí)須加以考慮。
2. 使用熒光探針的注意事項(xiàng) 不同的熒光探針在不同標(biāo)本的效果常有差異，除綜合考慮以上因素以外，有條件者應(yīng)進(jìn)行染料的篩選，以找出最適的熒光探針。
此外，許多熒光探針是疏水性的，很難或不能進(jìn)入細(xì)胞，須使用其乙酰羥甲基酯(acetoxymethyl，AM)形式，也就是熒光探針與AM結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解，去掉AM后的熒光探針不僅可與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，從而能有效地發(fā)揮作用。
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技術(shù)原理
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企業(yè)風(fēng)采
