如何使用ph梯度萃取法提取分離大黃中蒽醌類化合物
實驗原理：大黃為瀉下、清熱解毒、活血化瘀中藥，有“推陳致新”的作用。品種繁多，質(zhì)優(yōu)者為蓼科植物掌葉大黃（Rheum Palmatum L.）。藥用大黃（Rheum officinale Baill）和唐古特大黃（R·tang uticum Maxim ex Reg）的根。
大黃中具有瀉下作用的成分是幾種蒽醌衍生物，其中甙是主要的成分，因其瀉下作用常強于相應(yīng)的甙元，甙元主要包括大黃酚、大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素和大黃素甲醚共五種蒽醌甙元。大黃的致瀉效力與其中的結(jié)合性大黃酸含量成正比。游離的蒽醌甙元幾無致瀉作用。具有較強的致瀉作用的蒽醌甙有以下幾種：大黃酚-1-葡萄糖甙、大黃素-6-葡萄糖甙、蘆薈大黃素-8-葡萄糖甙、大黃酸-8-葡萄糖甙、大黃素甲醚葡萄糖甙、還含有蒽醌衍生物的雙糖甙，如：大黃素雙葡萄糖甙、蘆薈大黃素雙葡萄糖甙、大黃酚雙葡萄糖甙以及番瀉甙A和B，番瀉甙C，番瀉甙的瀉下作用，較蒽醌甙為強，但含量遠較后者為少。近年來，日本人西岡五夫從大黃中分離出四種新的大黃瀉下成分，稱大黃酸甙A、B、C、D。除此外還含有大黃鞣酸及相關(guān)物質(zhì)。如：沒食子酸（一部分是游離的，一部分是結(jié)合成沒食子酰葡萄糖甙），兒茶精，此類鞣質(zhì)及相關(guān)物質(zhì)有止瀉作用與蒽醌衍生物的甙類之瀉下作用恰恰相反。
1、大黃酚（chrysopanol）
金黃色片狀結(jié)晶。Mp196℃（乙醇或苯），能升華，可溶于丙酮、醋酸、氯仿、甲醇、乙醇、熱苯，微溶于石油醚、乙醚，不溶于水，NaHCO3和Na2CO3水溶液，可溶于NaOH溶液。
2、大黃素（Emodin）
橙黃色針狀結(jié)晶，mp256～257℃（乙醇或冰醋酸）能升華，其溶解度：乙醚0.14%，苯0.041%, 氯仿0.0718%，幾不溶于水，易溶于乙醇，可溶于稀氨水，Na2CO3水溶液。大黃素具有抑制小鼠黑色瘤和小鼠乳腺瘤的作用。
3、蘆薈大黃素（Aloeemodin）
黃色針狀結(jié)晶，mp223～224℃（甲苯）能升華，可溶于乙醚、苯、熱乙醇、稀氨水、Na2CO3和NaOH水溶液。
4、大黃酸（Rhein）
黃色針狀結(jié)晶，mp321～322℃（升華）。不溶于水，能溶于吡啶、碳酸氫鈉水溶液，微溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚、石油醚。大黃酸對艾氏腹水癌有抑制作用。
5、大黃素甲醚（Physcion）
紅色針晶mp206℃（苯）能升華。溶解性能似大黃酚。
6、羥基蒽醌甙類
①大黃素甲醚葡萄糖甙（Physcion monoglucoside）
黃色針晶mp235℃
②蘆薈大黃素葡萄糖甙（Aloe-emodin monoglucoside）
mp239℃
③大黃素葡萄糖甙（Emodin monoglucoside）
mp190～191℃淺黃色針晶
④大黃酸葡萄糖甙（Rhein monoglucoside）
mp266～270℃
⑤大黃酚葡萄糖甙（Chrysophanol monolucoside）
mp245～246℃
⑥大黃素-l-O-β-D-葡萄糖甙（1-0-β-D-glucopyranosyl emodin）
mp239～241℃
⑦蘆薈大黃素-W-O-β-D-葡萄糖甙（W-O-β-D- glucopyranosyl aloe-emodin）
mp187～189℃
⑧大黃酸甙A、B、C、D
大黃酸甙A：R=OH 大黃酸甙B：R=OH
大黃酸甙C：R=H 大黃酸甙D：R=H
本實驗根據(jù)大黃中的蒽醌苷類在酸性條件下加熱，可水解成游離羥基蒽醌和糖，而游離羥基蒽醌不溶于水，可溶于乙醚、氯仿等親脂性有機溶劑的性質(zhì)，從水解物中將游離羥基蒽醌提出，再利用游離羥基蒽醌的酸性不同，采用 pH梯度萃取法將其分離。也可利用游離蒽醌的極性不同，采用硅膠柱色譜方法進行分離。
儀器、材料及試劑
儀器：500mL圓底燒瓶、燒杯、滴管、橡皮管、球形冷凝管（750px）層析缸、標本瓶、索氏提取器一套、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽濾瓶、普通濾紙、薄層板、噴霧器、廣泛PH試紙。
材料及試劑： 大黃10～20g、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、硫酸、氨水、鹽酸、乙醚、石油醚、醋酸乙酯。
實驗步驟
1.游離蒽醌的提取
稱取大黃粗粉50g，加20%H2SO4水溶液150mL，在水浴上加熱3-4小時，放冷，抽濾，濾餅水洗至近中性，抽濾，于70℃干燥后，研碎，置索氏提取器中，加入乙醚150mL回流提取3-4小時，得到乙醚提取液。
乙醚提取液經(jīng)薄層層析檢查有大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚和大黃酚。薄層板為硅膠—CNC粘合板，展開劑為石油醚（60～90℃）：乙酸乙酯（7：3）近水平或直立展開，在可見光下，可看到四個斑點。其中Rf=0.9的黃色斑點為大黃酚和大黃素甲醚的混合物,在此條件下,不能分開,其余3個斑點依Rf值（由大到?。┑捻樞蚴谴簏S素（橙色斑點）、蘆薈大黃素（黃色斑點）、大黃酸（黃色斑點）。
2.PH梯度萃取分離
（1）將乙醚提取液加入250mL分液漏斗中，以40mL 2.5%NaHCO3水溶液萃取三次，乙醚層經(jīng)薄層層析檢查（薄層層析條件司上），提示乙醚提取液提出大黃酸后，合并三次NaHCO3萃取液，用濃鹽酸酸化，可得大黃酸沉淀。（注意：加酸時應(yīng)緩慢加入，以防酸液溢出）
（2）經(jīng)2.5% NaHCO3水溶液萃取后的乙醚層，繼以2.5% NaHCO3水溶液萃取三次，每次40mL，用薄層層析法檢查乙醚層，結(jié)果說明已提盡大黃素后，合并三次Na2CO3萃取液，并酸化，得大黃素沉淀。（酸化時注意操作同前）經(jīng)2.5% Na2CO3水溶液提取后的乙醚液，再以2.5% Na2CO3水溶液提取約四次，每次30mL，經(jīng)薄層檢查，指示提盡蘆薈大黃素，合并四次萃取液，酸化得蘆薈大黃素沉淀。（酸化時操作注意同前）
（3）經(jīng)2.5% Na2CO3水溶液萃取過后乙醚層以2.5% NaOH水溶液萃取至堿水層無色為止（約四次），每次50mL，合并NaOH萃取液，酸化得沉淀。過濾、水洗至洗出液呈中性。低溫干燥后溶于小體積石油醚中，作為柱層析的樣品溶液，用簿層層性析檢查樣品溶液有一個黃色斑點（為大黃酚和大黃素甲醚混合物的斑點），若改用下述紙層析條件可將兩者分開。
紙層析條件：新華濾紙7×20（cm）
展開劑：水飽和的石油醚（BP60～90℃）
展開方式：上行法
顯色劑：4%NaOH乙醇溶液
3.用纖維素粉柱層析法分離大黃酚和大黃素甲醚。
（1）纖維素粉的制備：
將新華濾紙（或其邊角紙屑）剪成小片，稱取15g，加入稀硝酸（每100mL水中加65～68%的硝酸5mL）300mL，加熱水解（約2小時），抽濾（G3號耐酸漏斗），濾餅用蒸餾水洗至中性，再加少量乙醇、乙醚依次各洗滌一次，待揮發(fā)掉殘存的乙醚后，低溫烘干，粉碎，過120目篩備用。
（2）裝柱：將纖維素粉約8g，用水泡和石油醚（BP60～90℃）按濕法裝柱。
（3）樣品上柱：將樣品溶液用移液管小心加入層析柱柱床頂端。
（4）洗脫：用水泡和石油醚（BP60～90℃）洗脫，分段收集，每份10mL，分別濃縮，經(jīng)紙層析檢查（紙層析條件同上），相同者合并，分別收集大黃酚和大黃素甲醚。大黃酚用醋酸乙酯重結(jié)晶后測熔點。
4.大黃酚的鑒定
（1）在薄層板上用點滴反應(yīng)檢查大黃酚對NaOH，MgAc2試液的反應(yīng)。
（2）測定大黃酚的紫外光譜。
（3）用溴化鉀壓片法，測定大黃酚的紅外光譜。
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標準
