水稻LEA基因組規(guī)模的鑒定與分析
實驗概要
本實驗鑒定了OsLEA基因，將基因定位到水稻染色上，進行了序列對比和基因轉(zhuǎn)變分析，LEA基因的表達分析及啟動子基序分析。
實驗材料
基因組及蛋白質(zhì)序列的來源：
分別從TIGR (http://www.tigr.org)和BGI (http://rise.genomics.org.cn/rice/link/download.jsp)下載Nipponbare和93-11基因組序列數(shù)據(jù)。從網(wǎng)站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/下載32127Nipponbare全長cDNA序列。白楊基因組數(shù)據(jù)從網(wǎng)站(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/ Poptr1.home.html)下載。所有數(shù)據(jù)的處理和分析皆在IBM P650的服務(wù)器上完成，使用IBM AIX的Unix操作系統(tǒng)。
實驗步驟
1. OsLEA基因的鑒定
使用HMMER的hmmpfam功能模塊，從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://www.sanger.ac.ulc/Software/Pfam)上搜索一段己知的LEA基因序列，LEA蛋白的HMM譜將其分成七類，分別是LEA_1， LEA-2，? LEA-3，LEAwe-4，LEA-5，Dehydrin和SMP。這些簡圖被用于在TIGR?? (http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osalpseudornolecules/info.shtml)上用HMMSEARCH程序掃描日本水稻基因組的染色體。在鑒定OsLEA基因后，將基因定位到水稻染色上。另外，從KOME(http://cdna0l.dna.affrc.go. jp/cDNA/)下載水稻的32，000全長cDNA (FL-cDNA)，通過全長cDNA和OsLEA基因的比對研究OsLEA基因的可變選擇性剪接。
2. 序列對比和基因轉(zhuǎn)變分析
用CLUSTAL X (V 1.81)程序在默認設(shè)置下完成預(yù)測OsLEA基因多序列比對。人工去除不保守區(qū)域。用GENECONV程序進行基因轉(zhuǎn)換檢驗，計算出全局和成對P值來估計被觀察片斷長度的統(tǒng)計顯著性。
3. LEA基因的表達分析
通過生物信息和實驗的方法研究OsLEA基因的表達。在生物信息方法的分析中，我們從TIGR Plant Transcript Assemblies (http://plantta.tigr.orgo)上選用BLASTN比對，取匹配率大于95%，檢索到OsLEA基因的FL-cDNA序列和EST序列。另外，從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.，gov/geo/)上的GEO下載了兩組水稻基因芯片數(shù)據(jù)來檢驗OsLEA基因的表達情況。其中一組為GSE661，含有ABA處理和GA處理的GSM9853，GSM9854，GSM9855，GSM9857，GSM9858，GSM9859和GSM9860。另一組是GSE2415，在幼苗時期經(jīng)過FS，F(xiàn)D，Dr，Os，滲透和冷害。
在實驗分析中，用半定量RT-PCR檢測用ABA或脅迫處理的一些OsLEA基因的表達情況。在溫室中用水培法種植粳稻的日本睛品種。在播種40天后分別用15%(v/v)PEG6000，0.1mM ABA和200mM NaCl處理六小時。未經(jīng)處理的幼苗作為對照。利用Trizol試劑盒，按照手冊的說明和Dnase處理，從對照和處理的幼苗地上部分提取總RNA。從總RNA合成cDNA第一鏈并做為sqRT PCR的模板。SqRT PCR的過程為：95℃ 5min，接著是95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，82℃ 5min循環(huán)32次，最后72℃延伸5mino OsLEA基因使用的擴增引物如表2所示。此外，在sqRT-PCR中使用肌動蛋白基因作為對照，以確保每次反應(yīng)中消耗等量的cDNA。肌動蛋白基因使用的引物為5'-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’和5'-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。
4. 啟動子基序分析
基于微陣列數(shù)據(jù)，OsLEA基因被分成受ABA處理或干旱處理誘導(dǎo)表達和無誘導(dǎo)表達兩組。檢驗誘導(dǎo)調(diào)控和非誘導(dǎo)調(diào)控的兩組基因，每個OsLEA基因利用全長cDNA來確定5’端上游1，00bp序列，從而來確定受ABA或干旱誘導(dǎo)的保守序列(順式作用元件)。用ELPH (http://www.cbcb.umd.edu/software/ELPH)程序的Gibbs取樣方法的默認參數(shù)設(shè)置來獲得保守序列。使用WebLogo程序?qū)⒋_定的基序按照它們在區(qū)域中的位置和它們的一致順序來劃分。
