trizol法提取RNA的方法及每一步的原理
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 提取組織RNA時(shí)，每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進(jìn)行裂解：提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5~106個(gè)細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈震蕩以裂解細(xì)胞；
2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在試問15~30℃下放置5分鐘；
3. 在上述EP管中，按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15~30℃）放置2~3分鐘后，12000g（2~8℃）離心15分鐘；
4. 去上層水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15~30℃）放置10分鐘后，12000g（2~8℃）離心10分鐘；
5. 棄上清，按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g（2~8℃）離心5分鐘，棄上清；
6. 讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥；
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀
各試劑的作用：
1、 TRIZOL
主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。
TRIZOL是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉淀回收RNA。
※0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。
※異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。
※β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。
2、 氯仿
為有機(jī)溶劑與水互不相溶，RNA（核糖核“酸”的鹽型）是離子化合物，溶于水相
3、異丙醇
能與與任意比例的水混合，因此加入異丙醇，能夠奪取RNA/DNA周圍的水分，RNA/DNA能夠聚集而發(fā)生沉淀。
