TRIzol法同時(shí)提取RNA、DNA、蛋白質(zhì)（二）
DNA的分離
準(zhǔn)備試劑：乙醇0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）、 75%乙醇、8mM NaOH
操作步驟：
1. 樣品加氯仿分層后，移去上層水相，用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用1mlTRIzol加0.3ml無水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，2～8℃不超過2000×g離心5分鐘。
2. 移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進(jìn)一步操作見后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml檸檬酸鈉，室溫放置30分鐘，2～8℃2000×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次?？梢栽僦貜?fù)一次。
3. 用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1ml TRIzol加入1.5～2 ml75%乙醇，室溫放置10～20分鐘（不時(shí)顛倒混合）2～8℃2000×g離心5分鐘， 棄上清。
4. 室溫放置晾干DNA 5～15分鐘，用8mM NaOH溶解DNA。從50～70mg組織或107細(xì)胞中分離的DNA溶于300～600μl 8mM NaOH，DNA的濃度通常為0.2～0.3μg/μl。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9，溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含一些膠狀不溶物可>12000×g離心10分鐘除去。
DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水測A260值。一單位A260值相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計(jì)細(xì)胞數(shù)，人、大鼠、小鼠、1×106二倍體細(xì)胞含DNA的量分別為7.1μg，6.5μg，5.8μg。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1×106細(xì)胞提取DNA分別為肝和腎3～4μg 骨骼肌，腦組織，胎盤2～3μg 人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細(xì)胞（1×106）5～7μg 成纖維細(xì)胞5～7μg。
應(yīng)用：
1.用于PCR 溶于8mM NaOH的DNA用0.1M HEPES調(diào)pH至8.4，取0.1～1μg DNA用作模板。
2.酶切反應(yīng)用HEPES或1mM EDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值。每μg DNA使用3～5單位的酶，80～90%的DNA是可消化的。
1ml 8mM NaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié)
Final pH ?0.1M HEPES（μl） Final pH ??1M HEPES（μl）
8.4 ??????86 ????????????????7.2 ????????23
8.2 ??????93??????????????? ?7.0 ????????32
8.0???? ?101
7.8 ?????117
7.5???? ?159
注意事項(xiàng)：
1. DNA在中間層和有機(jī)相中時(shí)可在2～8℃保存過夜。
2.DNA沉淀在75%乙醇中2～8℃可保存幾個(gè)月。
3.DNA在8mM NaOH溶液中4℃可放置過夜，如長期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至7～8并且加EDTA至1mM，可置于4℃或-20℃長期保存。
常見問題分析：
得率低：
A.樣品勻漿和裂解的不徹底。
B.最終得到的DNA沉淀沒有完全溶解。
A260/A280<1.70 ：
A. 檢測吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。
B.酚除去的不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。
DNA降解：
A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍。
B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。
C.樣品勻漿時(shí)使用了高速勻漿儀。
RNA污染：
A.氯仿分層后水相去除的不干凈。
B.DNA沉淀用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗的不徹底。
蛋白質(zhì)的提取
準(zhǔn)備試劑：異丙醇、含0.3M鹽酸胍的95%乙醇、無水乙醇、1%SDS。
操作步驟：
1.取沉淀DNA后剩余的上清，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1ml TRIzol加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，2～8℃12000×g離心10分鐘棄上清。
2.用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，2～8℃7500×g離心5分鐘，棄上清，重復(fù)兩次。用2ml無水乙醇同樣方法再洗一次。
3.真空抽干蛋白質(zhì)沉淀5～10分鐘，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復(fù)吸打，50℃溫浴使其完全溶解，不溶物2～8℃10000×g離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于Western Blot或-5至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
注意事項(xiàng)：
1.蛋白質(zhì)沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無水乙醇中2～8℃一個(gè)月以上或-5至-20℃一年以上。
2.用0.1% SDS在2～8℃透析三次，10000×g離心10分鐘取上清即可用于Western Blot。
常見問題分析：
得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底。
B.最后得到的蛋白質(zhì)沉淀未完全溶解。
蛋白質(zhì)降解：組織取出后沒有馬上處理或冷凍。
電泳時(shí)條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充分。
操作步驟：
1．? 用Trizol試劑勻漿細(xì)胞和組織的方法同RNA提取步驟。
2．? 在細(xì)胞勻漿中加入氯仿，每1ml Trizol的起始用量加入0.2ml氯仿。劇烈震蕩30秒鐘后室溫放置2~3分鐘。
3．? 4℃下10,000g離心10分鐘。
4．? 小心吸取并丟棄上層水相（該水相中富含細(xì)胞總RNA，如果需要提取RNA，則收集該水相）。
5．? 在剩下的中間層及有機(jī)相中加入無水乙醇，每1ml 起始Trizol用量加入0.3ml無水乙醇。顛倒充分混勻后室溫放置2~3分鐘。
6．? 4℃下2,000g離心5分鐘。
7．? 小心吸取并收集上層的酚醇有機(jī)相（沉淀為DNA），轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入異丙醇，每1ml 起始Trizol用量加入1.5ml異丙醇。輕輕混勻后室溫放置10分鐘。
8．? 4℃下12,000g離心10分鐘。
9．? 丟棄上層液相，沉淀即為蛋白質(zhì)。用清洗液（鹽酸胍溶于95%乙醇中，終濃度為0.3M）清洗沉淀3次。每1ml 起始Trizol用量加入2ml清洗液清洗。在每次清洗過程中，先將沉淀保留于清洗液中20分鐘（室溫下），然后在4℃下7,500g離心5分鐘。最后一次清洗后，丟棄上層液相，將沉淀懸浮于2ml乙醇中，渦旋震蕩15秒后在室溫下放置20分鐘，然后在4℃下7,500g離心5分鐘。
10.? 丟棄上層液相，將沉淀真空干燥5~10分鐘。然后將沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸鈉）中?？捎?0℃水浴中用tip頭反復(fù)吹打以助溶。不溶物在4℃下10,000g離心10分鐘去除。收集上清，轉(zhuǎn)移到新的收集管中。該上清中的蛋白樣品可直接用于Western Blotting實(shí)驗(yàn)或保存于-20℃。
附注：
1.? 蛋白沉淀保存于清洗液（鹽酸胍溶于95%乙醇中，終濃度為0.3M）中，或保存于乙醇中，在4℃下可保存至少一個(gè)月，在-20℃下可至少保存一年。
2.? 在上述步驟7中收集的酚醇有機(jī)相，可用0.1% SDS透析三次，透析后4℃下10,000g離心10分鐘。上清液可直接用于Western Blotting實(shí)驗(yàn)。如果采用這種實(shí)驗(yàn)方案，可提高蛋白的回收效率。
3.? 如果蛋白溶液中的SDS濃度高于0.1%，則不宜采用考馬斯亮蘭染色法（Bradford）法對蛋白定量。因?yàn)榈鞍兹芤褐锌赡芎泻哿糠?，也不宜采用紫外分光光度法定量蛋白質(zhì)。采用上述方法提取的蛋白，可以用lowry法或BCA法進(jìn)行蛋白定量。
