慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞步驟
一、慢病毒轉(zhuǎn)染 貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法
1、慢病毒轉(zhuǎn)染 前18-24小時(shí)，將貼壁細(xì)胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。
3、(對(duì)polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時(shí)后加入2ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。
4、繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基。
5、繼續(xù)培養(yǎng)。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后可見(jiàn)明顯熒光表達(dá)，72小時(shí)后更加明顯。如需FACS檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，可在轉(zhuǎn)染后72-96小時(shí)進(jìn)行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加藥篩選，可以在轉(zhuǎn)染3-4天后開(kāi)始加藥。
二、慢病毒轉(zhuǎn)染 懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法
1、在2×10^5/ml懸浮細(xì)胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒，充分混勻。37℃孵育。或者150g室溫離心4小時(shí)(選作，部分難轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞系采用此步驟可以提高轉(zhuǎn)染效率)。
2、(對(duì)polybrene毒性敏感的細(xì)胞選作此步驟)4小時(shí)后(或離心結(jié)束后)加入等體積新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。
3、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。中間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況可傳代或換液。
