實(shí)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)（二）
消化液：
分離組織和分散細(xì)胞。常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉 (EDTA) 兩種溶液。可以 單獨(dú)使用，也可以混合使用。
（1）胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶（簡(jiǎn)稱(chēng)胰酶）是一種黃白色粉末，易潮解，應(yīng)放置冷暗干燥處保存。目前應(yīng)用的胰蛋白酶主要來(lái)自?；蜇i的胰腺。胰酶的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相 互離散。胰酶對(duì)細(xì)胞的分離作用與細(xì)胞的種類(lèi)和細(xì)胞的特性有密切關(guān)系。一般來(lái)講，胰酶濃度大、作用溫度高、作用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞分離能力也大，但超過(guò)一定的限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰 酶溶液在 pH8.0，溫度為 37℃ 時(shí)，作用能力最強(qiáng)。注意：鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會(huì)降低胰酶活力。因此，胰酶溶液常用無(wú) Ca2+、Mg2+的 D-Hanks』 平衡鹽溶液配制成 0.25% 溶液。消化細(xì)胞時(shí)，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對(duì) 細(xì)胞的消化作用。
胰蛋白酶溶液配制：
（1）稱(chēng)取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許 D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調(diào)成糊狀， 然后再補(bǔ)足 D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫 4 小時(shí)或冰箱過(guò)夜，并不斷攪拌振蕩；
（2）次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過(guò)濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆?，常用濃?為 0.25% 或 0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào) pH 至 7.2 左右。
保存條件：配制好的胰蛋白酶溶液必須保存在-20℃ 冰箱中，以免分解失效。
EDTA?4Na 溶液
EDTA 是一種化學(xué)螯合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離觧作用，而且毒性小，價(jià)格低廉，使用方便。 常用工作液濃度為 0.02%。通常與 0.25% 的胰蛋白酶溶液按 1：1 混合使用（混合液）。
注意：使用 EDTA 處理細(xì)胞后，一定要用 Hanks 液沖洗干凈，因殘留的 EDTA 會(huì)影響
細(xì)胞生長(zhǎng)。
EDTA 溶液配制：用無(wú)鈣、鎂的 D-HBSS 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶， 室溫或 4℃ 冰箱保存。
胰蛋白酶–EDTA?4Na 溶液（0.05% 胰蛋白酶, 0.53 mM EDTA?4Na）
0.5 g 胰蛋白酶＋0.2 gEDTA?4Na＋1L D-HBSS。-20℃ 冰箱中保存。
pH 調(diào)整液
（1）NaHCO3 溶液
常用濃度為 7.5%。配制時(shí)用三蒸水溶解后，過(guò)濾除菌，分裝，4℃ 冰箱或室溫保存。 當(dāng) pH 值超過(guò)后，可用高壓滅菌的 10％ 醋酸溶液或通入 CO2 氣體方法調(diào)節(jié)。
（2）HEPES（分子量 238.31）溶液
HEPES 使用終濃度一般為 10-50 mM, 但通常配成 1M 儲(chǔ)存液：用 200 ml 雙蒸水溶解 47.6 克 HEPES，用 1N NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7.5-8.0; 然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，室溫或 4℃ 保存。 抗生素溶液
酚紅：
大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為 pH 指示劑。紅色表示中性 pH，黃色代表酸性 pH，紫色表 示堿性 pH。但是，在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅，因?yàn)橐延幸恍┭芯勘砻鳎悍蛹t能模擬類(lèi)固醇激素（尤其是雌激素）樣作用。
丙酮酸鈉：
是細(xì)胞液中細(xì)胞的另一種碳源。D-葡萄糖是細(xì)胞優(yōu)選碳源，但是當(dāng)培養(yǎng)液中 D-葡萄糖耗 盡時(shí)，細(xì)胞可以代謝丙酮酸鈉獲取碳源。
抗生素
哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存
主要目的：（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的最主要目的。
（2）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。
（3）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。
（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。
（5）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。
(6) 降低人力和物力。
冷凍保存要點(diǎn)：（1）冷凍過(guò)程要緩慢。需要冷凍保存的細(xì)胞先在 4℃ 冰箱中放置 30－60 分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20℃，放置 30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80℃ 放置 16－18 小時(shí)（或過(guò)夜）；最后放入液氮中長(zhǎng)期保存。有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1 到 -3℃ 速度降溫，一直 到-80℃ 以下，然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存。
（2）凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于 90％，無(wú)微生物污染。
（3）細(xì)胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。
（4）使用高濃度血清或蛋白保護(hù)劑。一般情況下，用于冷凍保存完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中血 清濃度大于 20％。
（5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中免受冰晶破壞。目前，最常用 的冷凍保護(hù)劑是 DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為 5－10％。但是，有些細(xì)胞系不能用 DMSO 作為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系 HL-60。因?yàn)椋珼MSO 能誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞分化。在這種情 況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油（glycele）, 羥乙基淀粉等。
特別注意：（1）細(xì)胞在冷凍過(guò)程中在-20℃ 冰箱內(nèi)放置時(shí)間不可超過(guò) 1 小時(shí)，以防止冰 晶過(guò)大而破壞細(xì)胞。也可跳過(guò)-20℃ 這一步驟直接放入-80℃ 冰箱中，但這樣做細(xì)胞存活率要
低一些。
（2）DMSO 稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。
（3）DMSO 必須是細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別的。新買(mǎi)的 DMSO 本身處于無(wú)菌狀態(tài)，第一次開(kāi)瓶后應(yīng) 立即少量分裝于無(wú)菌試管或瓶中，4℃ 保存。避免反復(fù)凍融造成 DMSO 裂解產(chǎn)生有 害物質(zhì)。并可減少污染機(jī)會(huì)。如要過(guò)濾 DMSO，必須選用耐 DMSO 的尼龍濾膜。
細(xì)胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑，基礎(chǔ)培養(yǎng)液，血清或蛋白。
常用細(xì)胞冷凍保存液：（1）10％DMSO ＋ 完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液（20％ 血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
（2）10％ 甘油 ＋ 完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液（20％ 血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）懸浮細(xì)胞冷凍保存操作程序（液氮保存法）：
（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)物，離心 200－400 g 5 分鐘。用粘附（貼壁）細(xì)胞冷凍保存操作程序（液氮保存法）：
冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇要點(diǎn)：（1）快速解凍。凍存細(xì)胞從液氮中取出后，應(yīng)立即放入37℃ 水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過(guò) 3 分鐘）。
（2）解凍操作過(guò)程動(dòng)作要輕。由于冷凍保存過(guò)的細(xì)胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快， 而且動(dòng)作要輕。一般情況下，解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)（1 ml 凍存細(xì)胞液加入到 25－30 ml 新鮮完全培養(yǎng)液中），24 小時(shí)后再用新鮮完全培養(yǎng)替換舊培養(yǎng)液，以去除 DMSO。如果，細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感，那么，解凍后 的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
特別注意：（1）解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入 37℃ 水浴中。切不可直接用手，以免凍傷。
（2）冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過(guò)凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。
解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法:
(1) 從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入 37℃ 水浴中快速解凍。
（2）將 1－2 ml 凍存細(xì)胞液加入到 25 ml 新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，輕輕混勻。
（3）用 80 g 離心 2－3 分鐘，棄上清液。
（4）用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。
（5）接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為 3×105/ml。
