小分子RNA（miRNA）簡(jiǎn)介
一、什么是小分子RNA（ MicroRNA）?
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? MicroRNA (miRNA) 是一類長(zhǎng)度約為20-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的具有調(diào)控功能的非編碼RNA。 miRNA
主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。這些miRNA基因首先在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成原始miRNA轉(zhuǎn)錄本（primary transcripts
miRNA,pri-miRNA），在核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成約60-70nt
的發(fā)卡狀miRNA前體（或者稱為pre-miRNA），然后Ran-GTP /Exportin
5將pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，隨后，另一個(gè)核糖核酸酶Dicer將其剪切成約為20-24個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的miRNA
:miRNA雙鏈。這種雙鏈很快被載入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，之后其中一條單鏈miRNA被降解，另一條成熟的單鏈miRNA分子通過與靶基因的3’UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)靶基因進(jìn)行降解或者翻譯抑制。
二、miRNA的特點(diǎn)
? ? 1． miRNA 在反復(fù)凍融，PH改變，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的穩(wěn)定性。
? ? 2． 相同的miRNA在不同細(xì)胞、不同組織器官以及不同種屬之間具有相似的序列以及調(diào)控功能。
? ? 3． miRNA在不同組織、不同細(xì)胞間的表達(dá)譜表現(xiàn)特征不同，因此miRNA表達(dá)譜可以作為某些組織或細(xì)胞的特異性分子標(biāo)志。
? ? 4． miRNA的組成在細(xì)胞的不同發(fā)育階段不同，特定的miRNA在特定細(xì)胞的特定階段出現(xiàn)，決定細(xì)胞的分化方向和分化時(shí)相，因此miRNA是細(xì)胞定時(shí)、定向分化的開關(guān)。
? ? 5． miRNA的調(diào)控不是一一對(duì)應(yīng)的，而是同時(shí)調(diào)節(jié)一組功能相似或相近的蛋白。
? ? 6． miRNA的調(diào)控力度不是很強(qiáng)，一般僅占蛋白表達(dá)量的30%或以下。
三、為什么miRNA會(huì)成為研發(fā)熱點(diǎn)？
1． 作為生物標(biāo)志物
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? 首先，miRNA在不同組織，不同細(xì)胞以及細(xì)胞的不同發(fā)育階段組成不同，是“天生的”良好標(biāo)志物；其次，miRNA
穩(wěn)定性甚佳，在反復(fù)凍融、PH改變、DNA以及RNA裂解酶的作用下都不容易降解，比較容易獲得；
還有，miRNA的調(diào)控為一控多，這也決定了miRNA的數(shù)量不會(huì)太多，最新數(shù)據(jù)顯示人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的miRNA總數(shù)為1048條。綜上所述，miRNA具備了很多優(yōu)質(zhì)生物標(biāo)志物所應(yīng)具備的特點(diǎn)。
2． 作為潛在藥物靶點(diǎn)
? ? 由于miRNA是通過對(duì)一組功能相似的蛋白進(jìn)行溫和調(diào)控以達(dá)到功能調(diào)控的目的，因此通過阻斷miRNA來調(diào)控生理功能理論上對(duì)于生物體本身會(huì)相對(duì)安全。因此miRNA是很好的潛在藥物靶點(diǎn)。
3． 作為基礎(chǔ)研究對(duì)象
? ? 通過對(duì)miRNA功能的研究，可以把蛋白質(zhì)按照功能重新分類，從而可以發(fā)現(xiàn)一些已發(fā)現(xiàn)蛋白的新功能，并與新的信號(hào)通路聯(lián)系起來，推動(dòng)基礎(chǔ)科學(xué)研究的進(jìn)步。
四、miRNA的檢測(cè)方法
1. 深度測(cè)序 (Deep Sequencing)
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深度測(cè)序是一種最新的高通量測(cè)序技術(shù)，它一次可以同時(shí)對(duì)幾十萬至幾百萬條DNA進(jìn)行測(cè)序。深度測(cè)序可以對(duì)一種生物、組織或細(xì)胞器進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組或代謝組進(jìn)行全面、深入、細(xì)致的分析。通過深度測(cè)序技術(shù)，我們可以對(duì)未知的miRNA進(jìn)行探索發(fā)現(xiàn)，對(duì)已知的miRNA進(jìn)行初步的定性半定量分析。
2. 基因芯片（Micro-Array)
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基因芯片技術(shù)興起于20世紀(jì)90年代，它是一種快速的、高通量的通過核酸雜交反應(yīng)的原理來測(cè)定基因表達(dá)量的技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)的出現(xiàn)使得對(duì)成千上萬基因表達(dá)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)成為可能。近年來隨著miRNA研究逐漸成為熱點(diǎn)，用于檢測(cè)miRNA的芯片產(chǎn)品也越來越多。該技術(shù)最主要的優(yōu)勢(shì)為具有極高的檢測(cè)通量，同時(shí)檢測(cè)成本較低。但是由于技術(shù)本身的限制，基因芯片只能顯示出2倍以內(nèi)的表達(dá)差異，因此也是屬于定性半定量檢測(cè)技術(shù)。
3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time qPCR)
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? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是1996年由美國(guó)Applied
biosystems公司推出在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA
(或cDNA) 的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA (或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法。
? ? 目前市場(chǎng)上miRNA qPCR檢測(cè)方法主要有以下兩種：1. 兩步法； 2.三步加尾法。兩種方法的主要差別在于qPCR之前的
cDNA制備過程（如圖）。其中兩步法是通過獨(dú)特設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。而三步法則是給miRNA序列加polyA尾，之后再利用反轉(zhuǎn)錄過程將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并加上獨(dú)特設(shè)計(jì)的尾部序列。
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? 兩步法的優(yōu)勢(shì)在于特異性很高，但是最新的研究報(bào)道顯示在編輯過程中，miRNA
的3’序列的多樣化現(xiàn)象(Heterogeneity)，這種現(xiàn)象的發(fā)生使得目前市場(chǎng)上qPCR兩步檢測(cè)法的準(zhǔn)確性受到影響（如圖）。而三步法則不受這一現(xiàn)象的影響，而且隨著科學(xué)家們的不斷摸索創(chuàng)新，三步法的特異性如今已經(jīng)可以和兩步法媲美。更重要的是低廉的價(jià)格也是三步檢測(cè)法越來越受到廣大研發(fā)人員喜愛的重要原因。五、miRNA的應(yīng)用舉例
1． 免疫學(xué)應(yīng)用 （T/B 淋巴細(xì)胞）
? ? 研發(fā)人員監(jiān)測(cè)大量已知miRNA在免疫反應(yīng)中表達(dá)的變化， 從而發(fā)現(xiàn)其在生理病理狀態(tài)下的重要作用。除此之外研發(fā)人員還可以發(fā)現(xiàn)和鑒定出新的生物標(biāo)志物，從而達(dá)到監(jiān)測(cè)免疫細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和組織器官的分化的目的。
2． 干細(xì)胞領(lǐng)域的應(yīng)用
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由于miRNA細(xì)胞特異性以及“時(shí)空”特異性的特點(diǎn)，近年來其在干細(xì)胞定向分化和自我更新功能維持中的作用，逐漸被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)。通過監(jiān)測(cè)大量已知miRNA在免疫反應(yīng)中表達(dá)的變化，研發(fā)人員可以在較短的時(shí)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)新的干細(xì)胞分化的標(biāo)志miRNA；
此外通過對(duì)已知的miRNA標(biāo)志物表達(dá)量的檢測(cè)，可以達(dá)到對(duì)干細(xì)胞的多能性以及分化進(jìn)行監(jiān)測(cè)的目的。
3． 癌癥領(lǐng)域的應(yīng)用
? ? 根據(jù)國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)告，某些miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。
? ? 根據(jù)miRNA在人體中起到的調(diào)節(jié)蛋白生成的特殊作用，我們認(rèn)為其在未來臨床檢測(cè)應(yīng)用方面具有廣闊的前景。
